【項目評估】

基因組信息分析

**  [ Homo sapiens (human) ]

Gene ID: **, updated on 2-Aug-2020

**基因具有3個轉(zhuǎn)錄本NR_002**.2 、NR_131**.1、NR_131**.1。需要在轉(zhuǎn)錄本的重疊位置設(shè)計靶點，進(jìn)行敲除，3轉(zhuǎn)錄本具有多個重復(fù)區(qū)域，可以設(shè)計出合適靶點。

細(xì)胞株分析

細(xì)胞敲除是否成功細(xì)胞培養(yǎng)影響很大，要求細(xì)胞株可以持續(xù)傳10代以上不能分化，而且需要較好的增值能力（因為需要培養(yǎng)細(xì)胞克?。?，細(xì)胞增值慢實驗周期會比較長，本實驗方案使用A375細(xì)胞株，可以達(dá)到實驗要求。

【項目報告】

1、基因組信息

Homo sapiens chromosome 11, GRCh38.p7 Primary Assembly

NCBI Reference Sequence:**

在第2-5顯子上下游分別設(shè)計靶位點（外顯子紅色字體）

     7621 gcgctgcacc catcccagaa tcccccaccc tggaaccccc atcccccttt tcatgtactc

     7681 ctccccatgc cccccagccc ccctctgccc aaggctggcc tcccccacat catgcccaca

     7741 gcccggattc cagagtcctc gagacaaatt gctgtaacag tgtttattga tgatgagtcc

     7801 agggctcctg ctgaagccct ggtggggagg ggcacagagc gagatggggc gtaatggaat

     7861 gcttgaaggc tgctccgtga tgtcggtcgg agcttccaga ctaggcgagg gcagggtgag

……

     8881 aggaaggccg gacgcgcctc ctctgtcctc gccgtcacac cggaccatgt catgtcctgc

     8941 ttgtcacgtc caccggacct ggcgtcttgg ccttcggcag ctggtgggca cgtccacccc

     9001 agctggagac ctggctgtgg ggagaacgag agagtcgtgt ggggagaacg tgttggttgt

     9061 gtggggaggg gcgggtgggg gctgagggtg gcagaggggg aaaaactcac cctcgtctcc

     9121 agcccgaacg ctgaggcacc gatcccggct ccgtcgccgc ccgcgaggcc cgccttggcc

靶點設(shè)計：

在線工具：http://crispr.mit.edu/

上游

Target-1

GACTCTGGAATCCGGGCTGT

Target-2

GGACTCTGGAATCCGGGCTG

下游

Target-3

GTCCGGTGGACGTGACAAGC

Target-4

GGCCAAGACGCCAGGTCCGG

2、構(gòu)建載體px458- **-T1、px458- **-T2、 px458-**-T3和px458- **-T4

3、轉(zhuǎn)染

（1）去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取（詳細(xì)步驟參見PureLink? HiPure Plasmid FP (Filter and Precipitator) Maxiprep Kit）

（2）轉(zhuǎn)染（步驟詳細(xì)參見Lipofectamine? 3000 Reagent）

（3）流式分選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞

（4）細(xì)胞克隆培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)染回收的GFP陽性細(xì)胞，采用極度稀釋的方法，將細(xì)胞放入10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，帶觀察到明顯的細(xì)胞克隆，將細(xì)胞細(xì)胞克隆傳代至96孔板，再繼續(xù)傳代至6孔板。

如圖：

（5）活性檢測

PCR產(chǎn)物凝膠瓊脂糖電泳檢測顯示，第6和第8細(xì)胞克隆靶位點區(qū)域條片段缺失較大，將6與8細(xì)胞克隆測序進(jìn)一步檢測靶點突變情況。

4、測序鑒定

PCR擴(kuò)增**靶位點序列，測序篩選，最終篩選得到**基因大片段敲除的細(xì)胞克隆。