科研服務 時間：2020-07-17 14:39:00 瀏覽：6338次
威斯騰生物經(jīng)過10多年的發(fā)展，獲得了上百種細胞株和四十余種原代細胞培養(yǎng)經(jīng)驗，并建立了龐大的細胞庫及原代培養(yǎng)資料庫。細胞平臺有資深實驗員、規(guī)范的SOP操作文件，萬級凈化細胞房，這些條件為保質保量完成每個客戶的實驗提供了保障。 同時，威斯騰生物結合多年原代及傳代細胞培養(yǎng)經(jīng)驗，結合平臺已有的技術優(yōu)勢，建立了完善的體外藥篩實驗，并引進RTCA(Real-time cellular Analysis，實時無標記細胞記錄儀），在藥篩過程中，全程實時記錄細胞真實狀況，為藥篩提供最真實精準的實驗數(shù)據(jù)。
無菌操作注意事項
細胞培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風30min，操作前需要換細胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，操作時不能大聲說話，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。
小鼠巨噬細胞的原代分離培養(yǎng)
培養(yǎng)板的包被
（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，洗滌劑浸洗、烘干。
（2）經(jīng) 5%鹽酸浸泡30min，自來水沖洗20min，三蒸水沖洗，浸泡過夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤干，放入 24 孔細胞培養(yǎng)板。
（3）用 0.01%的 L-多聚賴氨酸溶液包被培養(yǎng)皿和小玻片，37℃恒溫孵育 4h 或常溫過夜。
吸棄 L-多聚賴氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養(yǎng)孔及小玻片，晾干備用。
小鼠巨噬細胞的分離及培養(yǎng)
(1) 實驗開始前向小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白a的磷酸鹽緩沖液（PBS）。
(2) 3天后，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒小鼠皮膚。
(3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。
(4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 無菌PBS液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動。
(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內。
(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，1000r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，重復兩次，加入完全培養(yǎng)液重懸。
(7) 將濾液進行臺盼藍拒染試驗,血細胞計數(shù)板鏡下計數(shù)。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度將細胞以 400μl/孔接種到預先用L-多聚賴氨酸包被的24 孔培養(yǎng)板或 100μl/孔接種 96 孔培養(yǎng)板。
(8) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)24-48 h直到融合。
小鼠小膠質細胞的原代分離培養(yǎng)
培養(yǎng)板的包被
（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。
（2）經(jīng) 5%鹽酸浸泡30min，自來水沖洗20min，三蒸水沖洗，浸泡過夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤干，放入 24 孔細胞培養(yǎng)板。
（3）用 0.01%的 L-多聚賴氨酸溶液包被培養(yǎng)皿和小玻片，37℃恒溫孵育 4h 或常溫過夜。
去除 L-多聚賴氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養(yǎng)孔及小玻片，晾干備用。
小鼠小膠質細胞的混合培養(yǎng)
(1) 75%（體積分數(shù)）酒精消毒新生 24h 內的清潔級小鼠，在無菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取出腦組織，置于盛冷的pH7.2,無鈣、鎂的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
(2) 無菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質,分離大腦皮層，仔細剝離腦膜及血管。
(3) 用虹膜剪將組織剪切成 1mm3左右的組織塊，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期間振搖 2～3 次。
（4）棄去上清液，加入完全接種液終止消化，漂洗兩次。巴斯德吸管輕輕吹打至肉眼觀察無明顯的腦組織團塊，靜置 2min。
（5）懸液收集于新的離心管，離心（1000r/min，10 min，4℃），棄去上清液。加入完全培養(yǎng)液重懸，200 目不銹鋼網(wǎng)過濾。根據(jù)實驗需要接種于若干個25cm細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。
（6）置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后更換一次培養(yǎng)基，以后每3d換一次液，并在鏡下觀察細胞的生長和存活情況。
小膠質細胞的分離和純化
（1）細胞培養(yǎng)14～16d左右,在倒置相差顯微鏡下可觀察到混和膠質細胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)細胞分層現(xiàn)象, 即底層為扁平、多種形狀的、具有多個突起的星型膠質細胞,小膠質細胞明顯偏小呈類圓形、折光性強,附著于星型膠質細胞表面生長。
2）倒掉培養(yǎng)液,用0.05%胰酶2～3mL消化,邊觀察邊輕輕晃動培養(yǎng)瓶,等到貼附在星形膠質細胞上的小膠質細胞脫離下來,將含漂浮的小膠質細胞的消化液轉入10mL離心管，立刻用完全培養(yǎng)基終止消化。
（3）離心管配平,1000r/min, 離心5min, 棄上清；加定量完全培養(yǎng)再次吹打成細胞懸液,接種于預先包被的置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板,置于CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(37度)培養(yǎng)。
（4）生長24h后吸掉培養(yǎng)液,以去除未貼壁的少突膠質細胞,加完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
大鼠肝細胞原代分離培養(yǎng)
（1）麻醉及灌流：將大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作臺，0.45mm頭皮針連接蠕動泵，打開蠕動泵，調整蠕動泵灌流速度為7ml/min，抽取37℃預熱的灌流液I并排空裝置內的空氣。打開腹腔，將胃腸結構推向左腹上側，分離出下腔靜脈（腎上段）、肝門靜脈，剪開隔膜，動脈夾夾閉下腔靜脈肝上段，將頭皮針插入下腔靜脈（腎上段），動脈夾夾閉固定，打開蠕動泵，灌注37℃預熱的灌流液I，確定肝臟均勻膨脹后剪開肝門靜脈，繼續(xù)灌流至肝臟變成土黃色且肝門靜脈剪斷處流出無色灌流液為止，更換預先預熱的37℃灌流液II，直至肝臟表面出現(xiàn)白色裂紋時停止灌流。剪下肝臟，置于無菌D-Hanks溶液中。
（2）肝細胞的收集：將肝臟在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培養(yǎng)基中，眼科鑷撕開肝包膜，此時肝細胞會分散在培養(yǎng)基中，然后用200目不銹鋼細胞篩過濾，將濾液轉移至15ml無菌離心管。
（3）肝細胞純化：將收集的濾液以800rpm離心5min，棄去上清，用高糖DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，用200目不銹鋼細胞篩再次過濾，離心收集細胞沉淀。用高糖DMEM肝細胞生長培養(yǎng)液重懸細胞。
（4）肝細胞計數(shù)及活力檢測：取0.1ml肝細胞懸液與0.1ml PBS、0.1
ml40g/l的臺盼藍儲備液混合后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)收獲的肝細胞總量及存活率。
（5）將肝細胞懸液調整細胞5x105/ml接種于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，用高糖DMEM肝細胞生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。后續(xù)隔天換液培養(yǎng)。
威斯騰生物服務流程
威斯騰生物服務項目
| 細胞生物學檢測 | 高通量測序 | 代謝組學 |
| 細胞原代培養(yǎng) | mRNA測序 | 氣相色譜GC/MS |
| MTT檢測 | LncRNA測序 | 液相色譜LC/MS |
| 細胞凋亡檢測 | 全基因組測序 | 核磁共震NMR |
| 細胞周期檢測 | RNA-Seq測序 | |
| 細胞克隆形成實驗 | 外顯子測序 | 影像學相關實驗 |
| Transwell細胞遷移/侵襲 | 16s擴增子測序 | Micro-CT |
| 流式分選 | Small RNA測序 | 小動物活體成像 |
| CCK8/XTT檢測 | 宏基因組測序 | 核磁共振 |
| 臺盼藍檢測細胞活性 | 單細胞測序 | PET-CT |
| 藥物篩選細胞學實驗 | circleRNA測序 | |
| 細胞粘附性檢測 | 甲基化測序 | 基因編輯動物 |
| 細胞劃痕實驗 | 條件性敲除小鼠/大鼠 | |
| 細胞生物學整體實驗 | 全基因敲除小鼠/大鼠 | |
| 細胞成管實驗 | ||
| 病理檢測 | CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入 | 基因芯片 |
| 掃描電鏡 | 基因定點突變細胞系 | LncRNA芯片 |
| 透射電鏡 | 單基因敲除細胞系 | miRNA芯片 |
| HE染色 | 多基因敲除細胞系 | mRNA芯片 |
| 免疫組化 | 目的基因敲入細胞系 | 甲基化芯片（限人和小鼠來源樣本） |
| Tunel（原位末端凋亡法）檢測 | 報告基因敲入細胞系 | SNP芯片（限人和小鼠來源樣本） |
| 激光共聚焦 | miRNA/LncRNA敲除細胞系 | |
| 免疫熒光 | ||
| Masson染色 | CRISPR/Cas9動物敲除/敲入 |
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| 原位雜交 | 基因敲除大鼠/小鼠 |
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| 熒光原位雜交 | 基因敲入大鼠/小鼠 | |
| 特殊染色（PSA、茜素紅、阿爾新藍等） |
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| 行為學檢測 | 藥物篩選服務項目 | 藥效學評價 |
| 曠場實驗 | 高通量自動藥物篩選平臺 | 抗腫瘤藥物藥效學評價 |
| 重復性刻板行為檢測 | 細胞高內涵藥物篩選平臺 | 心血管系統(tǒng)藥物藥效學評價 |
| 動物跑臺檢測 | 蛋白質組學靶標研發(fā)平臺 | 泌尿系統(tǒng)藥物藥效學評價 |
| 強迫游泳 | 分子藥理研究平臺 | 內分泌系統(tǒng)藥物藥效學評價 |
| 生物膜片鉗藥物篩選平臺 | 抗炎免疫藥物藥效學評價 | |
| 常規(guī)藥物體外篩選 |
【本平臺合作項目】
分子生物學、細胞生物學、基因敲出/入、模式動物、SPF動物保種、病理學檢測、免疫學檢測、影像學檢測、原代培養(yǎng)、細胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩(wěn)轉株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學分析、知識產(chǎn)權服務！
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